植物中富含碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，同時也含有大量次生代謝產(chǎn)物。其在藥品、香料、染料、色素、殺蟲劑、食品添加劑等領(lǐng)域具有悠久的應(yīng)用歷史[1]。長期以來，植物資源己經(jīng)成為人類賴以生存的食物與藥品的重要資源之一。植物次生代謝產(chǎn)物是植物體中存在的一大類非生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，但在植物抗逆及抵御病蟲害等方面發(fā)揮著重要作用。

目前已報道的植物次生代謝產(chǎn)物主要包括生物堿、黃酮類、醛類、木脂素等，其種類達到數(shù)萬種以上。目前，部分次級代謝產(chǎn)物已被開發(fā)成商業(yè)化產(chǎn)品，具有廣闊的社會需求與重要的應(yīng)用價值。例如，青蒿素被用于痢疾的治療，紫草素用于抗菌，香蘭醛、玫瑰油用作香料，除蟲菊素、苦參堿、藜蘆堿用作殺蟲劑，蛇床子素、香芹酚、小檗堿等已被廣泛用于農(nóng)業(yè)病害的防治。

隨著對新品類藥用植物的研究以及先進技術(shù)的投入，越來越多的具有高生物活性的新型藥用植物次生代謝產(chǎn)物相繼被發(fā)現(xiàn)，對植物資源的需求正不斷增加。除野生采集外，藥用植物的人工栽培仍是目前提供原材料的主要途徑。人工栽培對植物種子、土壤、氣候條件等要求較高，栽培過程中易感染病害、部分藥用植物栽培時間長、管理成本高。同時，藥用植物栽培與農(nóng)作物栽培的爭地矛盾日益突出[1]，高活性植物次生代謝產(chǎn)物供需關(guān)系緊張[2]。

而利用植物干細胞生物反應(yīng)技術(shù)對經(jīng)誘導(dǎo)生成的植物單細胞進行大規(guī)模集中離體飼喂，以大量獲得高活性目標代謝產(chǎn)物是目前解決藥用植物資源問題的有效途徑。

一、植物干細胞概念及發(fā)展

植物組織培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)開始于19世紀后半葉，在Schleiden和Schwann創(chuàng)立的細胞學(xué)說基礎(chǔ)上，1902年德國植物生理學(xué)家Habedandt提出了著名的″植物干細胞全能性″論點[3]，認為植物干細胞具有在體外發(fā)育成完整植株的能力。但直到1934年，White[4]使用離體的番茄根部建立了第一個活躍生長的無性系，才使根的離體培養(yǎng)試驗首次獲得了真正的成功。二十三年后，Skoog和Miller[5]發(fā)現(xiàn)，激動素可以有效地促進外植體的細胞分裂和芽再生。其中最重要的是，高激動素/生長素比例誘導(dǎo)芽的發(fā)生而低激動素/生長素比例促進根的發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)奠定了植物組織培養(yǎng)中再生和細胞工程的基礎(chǔ)，揭開了激素調(diào)控植物器官再生的秘密面紗。Muir等人[6]利用萬壽菊愈傷組織建立了首個植物干細胞懸浮系。他們通過愈傷組織哺育方法成功地觀察到單個細胞可以分裂形成小的細胞團。1958年，Steward等人[7]將胡蘿卜根韌皮部的細胞進行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些細胞失去已分化細胞的結(jié)構(gòu)特征并發(fā)生反復(fù)的細胞分裂，最終形成胚胎并發(fā)育成具有根、莖、葉等器官的完整植株。同年，德國科學(xué)家Reinert[8-9]也獲得了類似的研究結(jié)果。此后，經(jīng)過研究人員50余年的不斷驗證，植物干細胞的全能性已經(jīng)得到充分驗證。

圖1. 不同品種的植物干細胞

二、植物干細胞生物反應(yīng)技術(shù)

與常規(guī)的栽培技術(shù)相比，植物組織和細胞培養(yǎng)進行藥用植物目標次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有顯著的優(yōu)越性。[10]與栽培植物不同，植物干細胞生物反應(yīng)技術(shù)使用工業(yè)化反應(yīng)器生產(chǎn)系統(tǒng)及配套回收工藝，在自動控制系統(tǒng)的加持下，可實現(xiàn)全年不間斷運轉(zhuǎn)。不受土壤環(huán)境、氣候條件、生物及非生物脅迫的影響。全培養(yǎng)周期無菌環(huán)境控制，無需使用農(nóng)藥防治病蟲草害的侵擾。同時，植物干細胞生物反應(yīng)所供給的基礎(chǔ)營養(yǎng)成分價格低廉，與哺乳動物、昆蟲、酵母細胞培養(yǎng)體系相比，成本效益更加顯著。

在作為生物合成底盤細胞方面，植物干細胞合成植物源天然代謝產(chǎn)物具有先天的優(yōu)勢。與細菌不同，植物干細胞作為真核系統(tǒng)，它們具有正確折疊和組裝多聚體蛋白質(zhì)的能力。此外，植物干細胞能夠進行在許多原核生物中很少發(fā)生的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，為生物合成通路調(diào)節(jié)增添了更多可能性。植物干細胞在對目標產(chǎn)物進行生物合成時，不會產(chǎn)生細菌毒素，合成系統(tǒng)安全性更高。另外，植物干細胞包含復(fù)雜的內(nèi)膜，能夠順利表達需定位于質(zhì)體系統(tǒng)的原生生物合成過程關(guān)鍵蛋白酶。

表1. 不同生物合成底盤情況對比

植物細胞遺傳轉(zhuǎn)化方法成熟穩(wěn)定，隨著新基因編輯工具的發(fā)展，異源基因的表達調(diào)控不再困難。通過對代謝途徑的研究，實現(xiàn)對目標產(chǎn)物生物合成路線關(guān)鍵基因、限速酶進行遺傳操作，提高目標產(chǎn)物生物合成量。亦可利用基因工程技術(shù)探索或人工創(chuàng)造全新生物合成路線，獲得本底細胞地盤品種不具備合成能力的其他目標代謝產(chǎn)物。將底盤細胞的優(yōu)勢及目標代謝產(chǎn)物合成能力相結(jié)合，大幅提升產(chǎn)量。同時，通過生物反應(yīng)轉(zhuǎn)化作用，能夠?qū)r值較低的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為高價值目標產(chǎn)物。植物干細胞生物反應(yīng)技術(shù)作為解決資源問題的有效途徑而成為了當(dāng)代生物技術(shù)的重要發(fā)展領(lǐng)域之一。

圖2. 植物干細胞生物反應(yīng)

作為生物合成底盤，植物干細胞展現(xiàn)出了其獨有的優(yōu)勢。轉(zhuǎn)基因或基因編輯工程細胞并非完整的植株品種，面臨更少的法規(guī)監(jiān)管上問題。但是，非模式植物原生干細胞獲取具有不確定性，高度復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制也給生物合成工作帶來了前所未有的挑戰(zhàn)。

表2. 植物干細胞生物催化合成案例[13]

三、植物毛狀根生物反應(yīng)技術(shù)

植物材料生物反應(yīng)工廠中最常用的生產(chǎn)系統(tǒng)是干細胞懸浮培養(yǎng)。然而，在特殊情況下，未分化的組織中可能無法產(chǎn)生某些特定次生代謝產(chǎn)物，或某些植物次生代謝產(chǎn)物的合成高度依賴于特定的組織器官時，毛狀根生物反應(yīng)技術(shù)提供了另一種解決方案。毛狀根生物反應(yīng)技術(shù)是利用發(fā)根農(nóng)桿菌浸染植物，使植物產(chǎn)生毛狀根。

圖3. 植物毛狀根生物反應(yīng)

該技術(shù)不需外源生長調(diào)節(jié)劑和額外光源，生長迅速、分支多、特定次生代謝物質(zhì)含量遠高于細胞懸浮培養(yǎng)含量。毛狀根生物反應(yīng)同樣也受營養(yǎng)成分、誘導(dǎo)子、前體和基因操作等因素的影響，是目前被認為最好的獲得植物次生代謝產(chǎn)物的原材料之一。

表3. 植物毛狀根生物催化合成案例[13]

目前，使用毛狀根生物反應(yīng)技術(shù)作為生物合成轉(zhuǎn)化的適合材料，正在獲得超越植物干細胞培生物反應(yīng)的優(yōu)勢。它們具有許多優(yōu)點，包括生化和遺傳穩(wěn)定性、對培養(yǎng)條件變化的敏感性較低、酶潛力與親本植物非常相似和低成本。

四、植物干細胞培養(yǎng)發(fā)展現(xiàn)狀與研究進展

1. 全球產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀

多年來，通過植物干細胞生物反應(yīng)技術(shù)生產(chǎn)藥用成分取得了很大的進展。目前已經(jīng)研究過的植物有400多種，能夠生產(chǎn)超過600多種的初級、次級代謝成分，其中有相當(dāng)大部分具有藥用價值，部分已成功實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。早在1956年，美國Routier和Nickell就提出了從植物干細胞培養(yǎng)合成天然產(chǎn)物的專利[10]。日本三井石油化工公司于1983年宣布將紫草寧作為染料和藥物進行工業(yè)化生產(chǎn)，此外，從毛地黃細胞培養(yǎng)物通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)地高辛，黃連細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)黃連堿，人參根培養(yǎng)生產(chǎn)人參皂苷等均實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。其他如長春花和彩葉紫蘇等細胞培養(yǎng)，也達到中試水平[12]。通過紅豆杉干細胞培養(yǎng)技術(shù)，紫杉醇生物合成量達到了1045mg/L,較親本植株提升超過298倍。積雪草總苷類合成量達到1670mg/g DW,已完全滿足產(chǎn)業(yè)化需求。比利時Green2chem公司以及法國Naturex等公司積極利用植物毛狀根生物反應(yīng)技術(shù)，成功實現(xiàn)了諸如煙堿、西利馬林、紫杉醇、奎寧、佛司可林等20余種高價值藥用成分的生物合成。在中國，紐蘭生物將植物細胞微囊泡作為藥物遞送介質(zhì)開展研究，截至2018年，該公司完成了天使輪融資，已建成噸級以上植物干細胞生物反應(yīng)設(shè)備。2022年初，美國Phyton公司投資30億元在徐州開工建設(shè)PCF植物干細胞生物反應(yīng)″超級工廠″，建成后預(yù)計銷售收入達70億元。

2. 生物合成助推植物源農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展

不積跬步，無以至千里。成都新朝陽作物科學(xué)股份有限公司（以下簡稱″新朝陽″）成立二十余年來，始終專注于農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展，是行業(yè)領(lǐng)先的植物源生物農(nóng)藥科技企業(yè)。植物源農(nóng)藥有效成分多為天然高活性次級代謝產(chǎn)物，其具有降解速度快、環(huán)境相容性好、低殘留等特點，符合當(dāng)下環(huán)保發(fā)展潮流，市場需求量持續(xù)增長。但隨著產(chǎn)業(yè)化進程的推進，藥用植物資源問題即將成為高活性天然產(chǎn)物運用的技術(shù)瓶頸。

圖4. 植物干細胞生物反應(yīng)技術(shù)基礎(chǔ)路線

新朝陽公司通過愈傷組織誘導(dǎo)，植物干細胞懸浮培養(yǎng)，毛狀根誘導(dǎo)等植物干細胞培養(yǎng)技術(shù)，開展植物干細胞生物反應(yīng)技術(shù)研究，目前已獲得重要進展。

圖5. 基因工程植物干細胞生物反應(yīng)階段性成果

新朝陽通過植物組織干細胞誘導(dǎo)技術(shù)，目前已獲得超過10余種具有生物合成開發(fā)潛力的植物底盤細胞材料。經(jīng)過生物反應(yīng)條件優(yōu)化，目前干細胞產(chǎn)量已達到550g/L。通過基因工程技術(shù)，成功實現(xiàn)了目標代謝產(chǎn)物的底盤異源表達，完成了多個工程細胞的代謝通路關(guān)鍵基因重組構(gòu)建。并成功實現(xiàn)了目標代謝產(chǎn)物的生物合成小試技術(shù)研究。為目標天然產(chǎn)物品種產(chǎn)業(yè)化技術(shù)目標推進頂定了堅實基礎(chǔ)。

五、植物干細胞生物反應(yīng)技術(shù)展望  

長期對珍稀藥用植物的盲目采集致使生態(tài)環(huán)境遭到破壞，許多野生植物瀕臨滅絕，一些特殊生態(tài)環(huán)境下的植物引種困難，能夠引種栽培的植物則需要占用大量的農(nóng)田，在耕地面積日益減少及保證18億畝耕地紅線的制約情況下，藥用植物的大規(guī)模種植受到嚴重制約。此外，人工栽培受環(huán)境因素的制約，天然植株中目的次生代謝產(chǎn)物含量過低，成分復(fù)雜又給產(chǎn)業(yè)化利用構(gòu)建了極高的開發(fā)成本壁壘。天然高活性藥用產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，手性中心數(shù)量多，傳統(tǒng)化學(xué)合成技術(shù)已無法滿足生產(chǎn)技術(shù)需求。面對上述諸多難題，科學(xué)工作者通過探索高等植物干細胞、器官等的大量培養(yǎng)技術(shù)，生產(chǎn)有用的次生代謝產(chǎn)物[14-16]，具有極大的社會意義。

據(jù)《中國植物源農(nóng)藥行業(yè)競爭現(xiàn)狀分析及企業(yè)投資策略研究報告》顯示，中國是全球農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，而生物農(nóng)藥（含農(nóng)用抗生素）占農(nóng)藥總量的比例不足12.5%，遠低于國際平均水平。生物農(nóng)藥受國家政策支持，符合當(dāng)下環(huán)保消費潮流，市場增速快。植物源農(nóng)藥作為生物農(nóng)藥的關(guān)鍵種類，具備廣闊的發(fā)展前景。

新朝陽作為一家從事原創(chuàng)生物技術(shù)研發(fā)的生物農(nóng)藥科技企業(yè)，通過植物干細胞生物反應(yīng)技術(shù)的創(chuàng)新突破，致力于解決植物源農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化的瓶頸，為保護生態(tài)環(huán)境和促進農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展做出貢獻。未來，新朝陽持續(xù)以作物為科研導(dǎo)向，持續(xù)提升植物源農(nóng)藥的防治效果和降低應(yīng)用成本，推動植物源農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展。

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